在分光光度計(jì)中,將不同波長(zhǎng)的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí),便可得到與眾不同波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度.如以波長(zhǎng)(λ)為橫坐標(biāo),吸收強(qiáng)度(A)為縱坐標(biāo),就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線.利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法,稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法.用紫外光源測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的方法,稱為紫外分光光度法;用可見光光源測(cè)定有色物質(zhì)的方法,稱為可見光光度法.它們與比色法一樣,都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ).

    近年來(lái),紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應(yīng)用,它不僅可以用于物質(zhì)的鑒定及結(jié)構(gòu)分析,而且還可以用于某些物質(zhì)含量的測(cè)定.

分光光譜技術(shù)可用于:

• 通過(guò)測(cè)定某種物質(zhì)吸收或發(fā)射光譜來(lái)確定該物質(zhì)的組成。
• 通過(guò)測(cè)量適當(dāng)波長(zhǎng)的信號(hào)強(qiáng)度確定某種單獨(dú)存在或與其他物質(zhì)混合存在的一種物質(zhì)的含量。
• 通過(guò)測(cè)量某一種底物消失或產(chǎn)物出現(xiàn)的量同時(shí)間的關(guān)系,追蹤反應(yīng)過(guò)程。

一、紫外及可見光分光光度法這是一種只在可見光及紫外光光譜應(yīng)用范圍內(nèi)測(cè)量物質(zhì)吸收放射線的技術(shù),應(yīng)用十分廣泛.其中分光光度計(jì)可用于測(cè)量特定波長(zhǎng)的吸收值,而比色計(jì)則是一種較簡(jiǎn)單的測(cè)量?jī)x器,其原理是利用慮光片來(lái)測(cè)量較寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍(lán)光范圍)的吸收值.

光吸收法則:

溶液對(duì)光的吸收有兩個(gè)基本法則:

①透過(guò)溶液的光的吸收值同吸收溶質(zhì)的分子數(shù)目(即溶質(zhì)濃度[C])呈指數(shù)相關(guān)。

②透過(guò)溶液的光的吸收值同透過(guò)吸收溶液的路徑長(zhǎng)度l成指數(shù)相關(guān)。

這兩條法則包括在比爾-朗伯關(guān)系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度來(lái)表示:

   ε其中ε對(duì)于吸收物質(zhì)及波長(zhǎng)是一個(gè)常數(shù),稱為吸光系數(shù)或吸收系數(shù),[C]的單位為mol/L或g/L,l的單位為ml.這一公式非常有用,因?yàn)榇蠖鄶?shù)分光光度計(jì)設(shè)計(jì)為直接測(cè)量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(舊教材中可能使用以廢除的術(shù)語(yǔ):光密度).對(duì)于遵循比爾-朗伯關(guān)系的物質(zhì),A與C呈線性關(guān)系.吸收值常用下標(biāo)表示其波長(zhǎng),如A550表示550nm處的吸收值.透過(guò)溶液的光的比例稱為透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.

吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:

    透光率(T)(transmittance)--通常以百分?jǐn)?shù)表示:T=(I/Io)×(一)比色計(jì)比色計(jì)用于測(cè)定顏色明顯,并且是溶液主要組分的待測(cè)物,如血液中的血紅細(xì)胞,也可以在待測(cè)物之中加入一種試劑,使其形成有色產(chǎn)物(一種生色團(tuán)),如用茚三酮法測(cè)定氨基酸含量.定量分析某種物質(zhì)要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線是在測(cè)定待測(cè)樣品的同時(shí)測(cè)定已知含量的物質(zhì)來(lái)制成的,而不是使用比爾-朗伯關(guān)系.

    光源通常為鎢絲燈泡,通過(guò)一個(gè)凸透鏡聚焦后產(chǎn)生一束平行光,平行光穿過(guò)裝有溶液的玻璃樣品或小池,然后透過(guò)一個(gè)有色濾光片到達(dá)光電管檢測(cè)儀,檢測(cè)儀產(chǎn)生一個(gè)同落在光電管上的光密度成正比的電勢(shì),來(lái)自于光電管的信號(hào)被放大然后傳遞到電流計(jì)或數(shù)字讀數(shù)器.

比色計(jì)的使用:

①接通電源使儀器穩(wěn)定,使用前至少要讓燈預(yù)熱5min；

② 選擇一種同底物顏色互補(bǔ)的濾光器；

③調(diào)零(用空白對(duì)照調(diào)零)；

④調(diào)整靈敏度；

⑤分析樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液；

⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此為了提高度,同一試驗(yàn)應(yīng)用同一比色杯,且在比色槽中擺放的方位相同；

⑦每次測(cè)樣前清洗比色杯；

⑧經(jīng)常重復(fù)測(cè)定同一溶液檢驗(yàn)比色計(jì)的可重復(fù)性；

⑨用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

     由于大多數(shù)過(guò)濾器過(guò)濾出來(lái)的光的波帶很寬,因而比色計(jì)既不能用于確定某種復(fù)合物,也無(wú)法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質(zhì).比色計(jì)所用光電管的變化系數(shù)為0.5%左右,因而不適合要求具有高度性的工作.使用這種zui簡(jiǎn)單的儀器,由于儀表上對(duì)數(shù)測(cè)量刻度單位的隨意性,即使是把表上的靈敏度/刻度調(diào)節(jié)到零控點(diǎn),在一個(gè)儀器上獲得的值不可直接同另一臺(tái)儀器上測(cè)得的值相比較,同一儀器的不同設(shè)置之間也不可直接比較.比色計(jì)對(duì)于特定波長(zhǎng)的量化工作是不合適的.

(二)紫外光/可見光分光光度計(jì)紫外光/可見光分光光度計(jì)基本裝置中采用高強(qiáng)度的鎢燈作為光源,能夠在可見光范圍(400~700nm)調(diào)節(jié).氘燈用于紫外分光光度測(cè)量(200~400nm);使用氘燈時(shí)要用石英杯,因?yàn)樽贤饩€不能透過(guò)玻璃.

    分光光度計(jì)之所以優(yōu)于比色計(jì)就在于使用了一個(gè)衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束.實(shí)際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個(gè)波長(zhǎng)的光,而是一段窄的帶寬上的光,帶寬是分光光度計(jì)的一個(gè)重要特性,這是由于它決定了吸收測(cè)量中所用的波長(zhǎng)--普通分光光度計(jì)的帶寬為5~10nm,用于研究的儀器的帶寬小于因?yàn)楣鈻艎A縫的寬度影響著帶寬,帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低,要獲得特定波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù),盡可能使用zui小的縫寬度.然而,減少了縫寬也會(huì)減少到達(dá)監(jiān)測(cè)器的光度,降低了信/噪比.縫寬可減少的程度取決于檢測(cè)/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在.

    大多數(shù)UV/可見光分光光度計(jì)使用的比色杯的光穿過(guò)路徑為10nm.一次性塑料杯適合于對(duì)水和乙醇溶液在可見光范圍內(nèi)的測(cè)量.玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),因而在研究中要使用玻璃比色杯,尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時(shí)(<0.1),即使盛對(duì)照液與待測(cè)樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同,也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差.玻璃和塑料會(huì)吸收UV光,因此在測(cè)波長(zhǎng)小于300nm的吸收值時(shí)要使用石英杯.

    進(jìn)行測(cè)量之前,比色杯要保證干凈,無(wú)劃痕,外表面干燥,盛液到適當(dāng)高度,并放在了比色槽中的正確位置.生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會(huì)在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過(guò)后.腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯,以防止濺出,破壞儀器.

     基本分光光度計(jì)使用的光電管類似于比色計(jì)中所使用的光電管.許多情況下,當(dāng)波長(zhǎng)高于和低于550~600nm時(shí)必須使用不同的光電管,這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诳梢姽獠ㄩL(zhǎng)內(nèi)的靈敏度不同,更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測(cè)器.數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺(jué)錯(cuò)誤和誤讀范圍的錯(cuò)誤,正逐漸代替指針讀數(shù).一些儀器可以直接給出所測(cè)定物質(zhì)的濃度.

紫外光/可見光分光光度計(jì)的類型:

   基本分光光度計(jì)只產(chǎn)生單束光.這種儀器首先用空白對(duì)照調(diào)到零吸收值,然后取出空白液,加入待測(cè)液,測(cè)定待測(cè)液的吸收值.也有一種雙束分光光度計(jì),有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束,一束穿過(guò)待測(cè)液,另一束穿過(guò)空白液.吸收值由一個(gè)電子線路通過(guò)對(duì)比透過(guò)待測(cè)液及空白液的出射光進(jìn)行測(cè)定.雙光束分光光度計(jì)減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測(cè)量錯(cuò)誤,這時(shí)由于待測(cè)液與對(duì)照液是同時(shí)進(jìn)行測(cè)量的.記錄式分光光度計(jì)是一種雙束測(cè)定儀,用于記錄已知波段下吸收值隨時(shí)間的變化(如用于酶分析).

分光光度計(jì)的定量分析:

     假如已知一種物質(zhì)在某一波長(zhǎng)下的吸光率(通常是該物質(zhì)的zui大吸收值,這時(shí)靈敏度zui高),這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼?朗伯關(guān)系式算出.摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下,比色杯厚度為1cm時(shí)的吸收值.該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到,也可以用實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)測(cè)量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來(lái)繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線.這樣,在所要求的濃度范圍內(nèi),便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系,該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。

    比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時(shí),比色杯厚度為1cm時(shí)測(cè)定的吸光值.該值對(duì)于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測(cè)定很有用,這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時(shí),比吸光率要除以10才可以得到一個(gè)以g/L為單位的濃度值。

    這種簡(jiǎn)單的方法不能用于測(cè)定混合樣品.在這種情況下,也許可以通過(guò)測(cè)量幾個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)估算每種成分的含量,如可用此方法在核酸存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的估算。

分光光度計(jì)的使用方法:

(1)接通電源;(2)使用前預(yù)熱15min;(3)選擇波長(zhǎng);(4)選擇檢測(cè)器;(5)如果可能的話,選擇正確的縫寬;(6)插入適當(dāng)?shù)目瞻讓?duì)照;(7)調(diào)解到0%的透過(guò)率;(8)將吸光值調(diào)到零;(9)分析樣品;(10)每測(cè)量10個(gè)樣品后,用空白對(duì)照校驗(yàn)零刻度;(11)檢測(cè)儀器的可重復(fù)性.